体外模型为评估癌细胞对药物和辐射的反应提供了一个平台。然而，由于无法模拟体内自然发生的3D环境，传统2D单层细胞培养存在很大局限性。为了寻找更真实的模拟环境，代尔夫特理工大学（Delft University of Technology）的科学家们利用Nanoscribe的3D微纳加工系统制作了3D工程细胞微环境，并且首次在质子束放射实验中研究了所培养的胶质母细胞瘤细胞3D打印支架，以探究其对辐射的反应。令人印象深刻的是，该实验结果显示，与2D单层细胞相比，3D工程细胞培养中的DNA损伤得到了显著降低。
癌症是全世界一个主要死亡原因，2020年有近1000万人死于癌症[1]。而其中胶质母细胞瘤是一种极具破坏性的脑肿瘤，其癌细胞增殖非常快且具有侵略性。为了研究、治疗和破坏脑肿瘤细胞，研究人员正在研究使用质子放射治疗，该治疗手段已被证明在不同癌症类型中比x射线放射治疗更有效和微创的技术。然而，质子放射治疗的成本很高，这使得在动物和人类身上进行的试验也变得非常昂贵，几乎无法进行。质子放射治疗的高成本也导致缺乏从细胞水平了解质子对胶质母细胞瘤影响的临床研究。
代尔夫特理工大学Delft University of Technology的科学家们在Angelo Accardo教授的带领下，采用一种全新的方法来研究质子束放射下的体外胶质母细胞瘤细胞培养，该研究成果被刊登在ACS Applied Materials & Interfaces封面。为了制作由3D工程细胞微环境制成的体外细胞培养物，科学家们利用双光子聚合技术（2PP）来制造模拟脑血管几何形状的仿生3D支架，该仿生几何结构影响胶质母细胞瘤细胞及其定植机制。在该实验中，细胞可以在定制3D支架几何结构的引导下以受控方式生长。只有在强聚焦的激光焦点处才能发生双光子吸收的光聚合反应可实现在亚微米范围内打印最精细的3D特征结构。此外，这种增材制造技术可在微米级别实现高度三维设计自由度，并以最高精度模拟三维细胞微环境。
在这个研究项目中，3D打印制作的细胞支架仅有150微米高度，包括一个八角形底座和一个与底部形状相似但更小的八角形顶部，形成一个 八角形截顶金字塔。通过共聚焦显微镜观察该截顶金字塔可以量化分析大量细胞，而SEM图像则可以显示与支架几何结构相关的细胞形态的更多细节。在3D微环境中，细胞通常比在2D基座上形成更为球形的形式。该金字塔由直径为10µm和6µm的水平和倾斜梁组成，非常符合细胞生长尺度。这些梁为细胞粘附和机械稳定性提供支撑，以避免支架在细胞机械刺激下坍塌。3D细胞培养的特征在于细胞骨架从细胞向支架梁的方向延伸。细胞在2D支架上不能实现与实际符合的单层细胞平面，而在3D微环境中的细胞可以在支架的内部核心以及架构的外部框架上繁殖。
科研项目中所打印制作的支架采用了Nanoscribe公司IP-Visio系列光敏树脂材料。该打印材料符合ISO-10993-5生物相容检测，是一种非细胞毒性材料，有利于胶质母细胞瘤细胞的生物相容性、生长和粘附。此外，IP- Visio打印材料具有可忽略不计的低自发荧光的特性，可在使用细胞显微镜观察的同时不干扰细胞染色。因此，IP-Visio打印材料适用于细胞生物标记物的免疫荧光成像。由于IP-Visio在文中科研项目的特定细胞应用中能促进支架结构上的细胞粘附性，因此无需额外的生物功能化或生物化学涂层。
此外，在2D基座上测得的IP-Visio杨氏模量为1.31GPa，这几乎是传统用于细胞培养的钠钙玻璃基板杨氏模量的50倍（E ≈ 70 GPa）。虽然IP-Visio仍未达到脑细胞外基质的杨氏模量，但它却提供了一个相当软的环境，可以刺激细胞与细胞和细胞与支架的相互作用，并在2D和3D微环境中形成显而易见不同的细胞形态。因此，Nanoscribe的双光子聚合技术和IP-Visio打印材料的搭配使用为由细胞友好的生物材料制成的复杂仿生环境奠定了基础，该仿生环境可以为细胞提供机械、生物化学和几何刺激。
3D工程支架由合适的生物材料配合高精度3D微纳加工技术而制造，用于胶质母细胞瘤微环境。在支架灭菌后，将胶质母细胞瘤细胞在支架上培养5天。同时，对2D基座重复相同的步骤作为对比。随后将细胞定植的支架进行质子束辐射测试。经过质子放射后，使用共焦显微镜分析质子放射前后2D基座和3D微环境上的细胞。在共焦图像中，荧光生物标记物（γH2A.X）显示，与三维微环境相比，2D基座上的细胞中形成了更多的DNA损伤灶，而病灶数量与细胞中的DNA损伤有关。该实验证实了3D细胞培养中胶质母细胞瘤细胞的DNA损伤低于2D单层细胞，这与体内胶质母细胞癌细胞的反应相关。
这些研究结果可能与胶质母细胞瘤细胞的放射抗性或2D单层细胞和3D细胞网络之间修复动力学的差异有关。全新制作的3D微环境将是有前景的基准工具，可用于研究质子放射治疗对胶质母细胞瘤细胞和其他类型癌细胞的影响。
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[1] Global Cancer Statistics 2020
Image source: CC by 4.0 Qais Akolawala et al., ACS Appl. Mater. Interfaces 2022, 14, 18, 20778–20789, doi: 10.1021/acsami.2c03706. The images were adapted for the required formats.
