3Dプリンティングを用いて脳組織を模倣し、がん陽子線治療の新たな道を切り開く

がんは、世界における主な死因の一つであり、2020年には約1,000万人が死亡すると言われています[1]。グリオブラストーマは、がん細胞の増殖が非常に速い、脳の破壊的ながんです。脳腫瘍の研究、治療、破壊のために、研究者らは陽子線照射を研究しています。陽子線は、さまざまな種類のがんにおいて、X線放射線療法よりも効果的で侵襲性の少ない技術であることが証明されています。しかし、陽子線治療はコストが高いため、動物や人間での実験も非常に高価で、ほとんど手が出せないのが現状です。また、陽子線治療における高いコスト は、グリオブラストーマに対する陽子の効果を細胞レベルで理解するための臨床研究の欠如にもつながっています。

3Dプリンティングによるバイオミメティック細胞スキャフォールド

Angelo Accardo教授率いるデルフト工科大学の科学者たちは、陽子線照射下におけるin vitro グリオブラストーマ細胞培養を研究する有望な新しいアプローチでこの課題に取り組み、ACS Applied Materials & Interfacesの表紙を飾りました。彼らは、3D化した細胞微小環境からなるin vitro細胞培養を開発しています。この目的のために、2光子重合（2PP）を用いて、脳血管の形状を模倣したバイオミメティック3Dスキャフォールドを作製しています。このバイオミメティックな形状は、グリオブラストーマ細胞とそのコロニー形成の仕組みに影響を与えます。これらの実験では、3D細胞培養はスキャフォールドベースであるため、細胞は3Dのスキャフォールド形状により誘導されて制御した方法で増殖することができます。2PPによる光重合は、レーザーの狭い焦点でのみ起こるため、サブミクロンオーダーの微細な形状を3D造形することが可能です。さらに、このアディティブ・マニュファクチャリング技術は、マイクロメートルスケールの3Dのデザイン自由度を最大限に活用し、3Dの細胞微小環境を高精度に模倣することに適しています。

このプロジェクトでは、高さわずか150マイクロメートルの細胞スキャフォールドを3D造形しています。このスキャフォールドは、八角形の底面と、同じ形状で底面よりも小さい八角形の最上層を持つ、八角錐台を形成しています。共焦点顕微鏡では、角錐台で定量的に大量の細胞を分析でき、一方でSEM画像ではスキャフォールドの形状に関連した細胞の形態についてより詳細を写しだします。3D微小環境では、細胞は2Dの台座上よりもしばしば球状になります。角錐には、直径10μmと6μmの水平梁と傾斜梁があり、細胞の大きさによく適合します。梁は細胞接着のための領域を提供し、細胞の機械的刺激でスキャフォールドが崩壊するのを防ぐための機械的安定性を提供します。3D細胞培養は、細胞骨格が細胞からスキャフォールドの梁の方向に伸びていることが特徴です。2Dの台座上では細胞は非現実的な細胞平面単層膜を形成しますが、3D微小環境上では細胞はスキャフォールドの内核だけでなくアーキテクチャの外枠にもコロニーを形成しています。

細胞の培養、増殖、接着、顕微鏡観察用の専用バイオマテリアル

このスキャフォールドは、ISO-10993-5に基づく無細胞毒性材料であるNanoscribeのIP-Visioフォトレジストを用いて作られています。このバイオマテリアルは、細胞の生体適合性、増殖、グリオブラストーマ細胞の接着に有益です。さらに、IP-Visioは、細胞顕微鏡で使用する際に細胞の染色を妨げない、ごくわずかな自家蛍光を有しています。このように、IP-Visioは、細胞バイオマーカーの免疫蛍光イメージングに適しています。IP-Visioをこの特定の細胞アプリケーションに使用する場合、この材料が構造体への必要な細胞接着を促進するため、追加の生体機能化またはバイオケミカルコーティングは不要でした。

さらに、2D台座で測定したIP-Visioのヤング率は1.31 GPaで、一般的に細胞培養に用いられる従来のソーダライムガラス基板のヤング率（E≈70 GPa）のほぼ50分の1でした。

脳の細胞外マトリックスのヤング率にはまだ遠く及ばないものの、IP-Visioは、細胞-細胞間および細胞-スキャフォールド間の相互作用を刺激し、2Dと3Dの微小環境上で非常に明確に異なる細胞形態をもたらす、かなり柔らかい環境を提供してます。このように、Nanoscribeの2光子重合とIP-Visioの組み合わせは、細胞に機械的、生化学的、幾何学的刺激を与えることができる、細胞に優しい生体材料でできた複雑なバイオミメティクス環境を設計する道を開くものです。

陽子線治療におけるがん細胞の挙動を探求する

高精細3Dプリンティングと適切な生体材料の能力を用いて3Dエンジニアしたスキャフォールドは作製され、グリオブラストーマ微小環境として使用することができます。スキャフォールドを滅菌した後、スキャフォールド上でグリオブラストーマ細胞を5日間培養します。比較のため、2次元台座についても同じ手順を繰り返します。この後、細胞が定着したスキャフォールドに陽子線照射を行い、共焦点顕微鏡を用いて陽子線照射前後の2次元台座と3D微小環境上の細胞の状態を解析しました。共焦点画像では、蛍光性バイオマーカー（Gamma H2A.X）により、3D微小環境と比較して2次元台座上の細胞ではDNA損傷fociが多く形成されていることが明らかになりました。fociの数は細胞内のDNA損傷に関連しており、3D細胞培養では2次元細胞単層よりもグリオブラストーマ細胞のDNA損傷が少ないことが確認され、これはグリオブラストーマ細胞の生体内での反応と相関しています。

これらの知見は、グリオブラストーマ細胞の放射線抵抗性の違い、あるいは2D細胞単層と3D細胞ネットワークの修復動態の違いに関連している可能性があります。この新しい3D微小環境は、グリオブラストーマ細胞や他の種類のがん細胞に対する陽子線治療の効果を研究するための有望なベンチマークツールです。