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28. Juli 2022

3D-gedrucktes Hirngewebe bringt neue Erkenntnisse für die Krebsprotonentherapie

Biokompatible 3D-Gerüste mit kultivierten Glioblastom-Zellen werden Protonenstrahlen ausgesetzt
Biokompatible 3D-Gerüste mit kultivierten Glioblastom-Zellen werden Protonenstrahlen ausgesetzt, um die Zellreaktion auf die Bestrahlung zu untersuchen. Im Vergleich zu 2D-Zellmonolage weisen 3D-Netzwerke aus Hirnkrebszellen weniger DNA-Schäden auf. Die 3D-Gerüste wurden mit der Zwei-Photonen-Polymerisationstechnologie von Nanoscribe gedruckt. Bild: Quellenhinweis unten in dieser News

In-vitro-Modelle bieten eine Plattform für die Untersuchung von Krebszellen und ihre Reaktion auf Arzneimittel oder Bestrahlung. Standarisierte Zellkulturen in 2D-Monolagen haben jedoch ihre Einschränkungen: Sie können nicht die natürliche, dreidimensionale In-vivo-Zellumgebung wie im Körper nachahmen. Mit dem Ziel viel realistischere Modelle für die Krebsmedizin einzusetzen, entwickeln Wissenschaftler der TU Delft 3D-Zell-Mikroumgebungen mit einem 3D-Drucker von Nanoscribe. Erstmals sind 3D-gedruckte Gerüste mit kultivierten Glioblastom-Zellen für die Protonenstrahltherapie untersucht worden, um die Zellreaktion auf die Bestrahlung genauer zu verstehen. Erstaunlicherweise zeigen die Ergebnisse eine deutlich geringere schädliche Wirkung auf die DNA in 3D-Zellkulturen im Vergleich zu 2D-Zellmonolagen.

Krebs ist eine der dominierenden Todesursachen weltweit mit fast 10 Millionen Todesfällen im Jahr 2020 [1]. Das Glioblastom ist eine verheerende Krebserkrankung des Gehirns, deren Krebszellen sich sehr schnell und aggressiv vermehren. In der Krebsbehandlung setzen immer mehr Wissenschaftler auf die neue Protonenstrahltherapie, die sich für verschiedene Krebserkrankungen im Vergleich zur Röntgenstrahltherapie als effektiver und minimal invasiver erwiesen hat. Die Kosten für die Protonentherapie sind jedoch hoch, was die Versuche an Tieren and Menschen ebenfalls sehr kostspielig und fast unerschwinglich macht. Das führt auch zu einem Mangel an klinischen Studien, um die Wechselwirkung von Protonen mit dem Glioblastom auf zellulärer Ebene besser zu verstehen.

3D-Druck biomimetischer Zellgerüste

Wissenschaftler der Technischen Universität Delft unter der Leitung von Professor Angelo Accardo stellen sich dieser Herausforderung mit einem vielversprechenden neuen Ansatz zur Untersuchung von in-vitro-Glioblastom-Zellkulturen unter Protonenbestrahlung, der im Journal ACS Applied Materials & Interfaces vorgestellt wird. Die Forschergruppe entwickelt in-vitro-Zellkulturen auf 3D-gefertigten zellulären Mikroumgebungen. Mit der Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP) stellen sie biomimetische 3D-Gerüststrukturen her, die die Geometrie der Hirnblutgefäße nachahmen. Die biomimetische Struktur beeinflusst die Glioblastom-Zellen und ihre Kolonisierungsmechanismen. Für diese Experimente werden die Zellen auf synthetische 3D-Gerüsten kultiviert. So können die Zellen beeinflusst durch die Gerüstgeometrie dreidimensional wachsen. Die bei dem 2PP-basierten 3D-Druck räumlich sehr eingegrenzte Photopolymerisation, die nur im engsten Laserfokus stattfindet, ermöglicht die Fertigung feinster Strukturen im Submikrometerbereich. Diese additive Fertigungstechnologie nutzt die volle 3D-Designfreiheit im Mikrometermaßstab und ist für die Nachahmung von zellulären 3D-Mikroumgebungen mit höchster Präzision bestens geeignet.

In diesem Projekt werden Zellgerüste mit nur 150 Mikrometer Höhe 3D-gedruckt. Die Gerüste bestehen aus einer oktogonalen Basis und einer ebenfalls oktogonalen obersten Schicht, die kleiner als die Basis ist. Beide bilden eine abgestumpfte Pyramide. Die konfokale Mikroskopie profitiert von den Pyramidenstrukturen, die die Analyse einer großen Anzahl von Zellen zulassen, während REM-Bilder mehr Details über die Zellmorphologie in Verbindung mit der Geometrie der Gerüste offenbaren. Auf den 3D-Mikroumgebungen nehmen die Zellen häufiger eine sphärischere Form an als auf 2D-Sockeln. Die Pyramiden bestehen aus horizontalen und geneigten Balken mit Durchmessern von 10 und 6 Mikrometern, die ziemlich genau dem zellulären Maßstab entsprechen. Die Balken bieten Bereiche für die Zelladhäsion und mechanische Stabilität, um zu verhindern, dass das Gerüst unter zellulärer mechanischer Stimulation zusammenbricht. Die 3D-Zellkultur ist durch das Zytoskelett gekennzeichnet, das sich von den Zellen in Richtung der Gerüstbalken erstreckt. Während die Zellen auf 2D-Sockeln unrealistische flache zelluläre Monolagen bildeten, besiedelten die Zellen auf den 3D-Mikroumgebungen sowohl den inneren Kern der Gerüstarchitektur als auch das äußere Gerüst.

Biomaterial für Zellkultur, Adhäsion, Wachstum und Mikroskopie

Die Gerüststrukturen bestehen aus dem Fotolack IP-Visio von Nanoscribe, einem nicht zytotoxischen Material gemäß ISO-10993-5. Dieses Druckmaterial ist für die Biokompatibilität, das Wachstum und die Adhäsion von Glioblastom-Zellen von Vorteil. Darüber hinaus weist IP-Visio eine vernachlässigbare Autofluoreszenz auf, sodass die Zellfärbung bei der Zellmikroskopie nicht beeinträchtigt wird. Daher ist IP-Visio für die Immunfluoreszenz-Bildgebung von Zell-Biomarkern geeignet. Für den Einsatz von IP-Visio in dieser speziellen Zellanwendung war keine zusätzliche Biofunktionalisierung oder biochemische Beschichtung erforderlich, da das Material die erforderliche Zelladhäsion an den Strukturen fördert.

Der auf 2D-Sockeln gemessene Elastizitätsmodul von IP-Visio liegt bei 1,31 GPa und damit fast 50-fach niedriger als der Elastizitätsmodul herkömmlicher Kalk-Natron-Glassubstrate (E ≈ 70 GPa), die normalerweise für Zellkulturen verwendet werden. Obwohl er noch weit vom Elastizitätsmodul der extrazellulären Matrix des Gehirns entfernt ist, bietet IP-Visio eine eher weiche Umgebung und stimuliert damit die Zell-Zell- und Zell-Gerüst-Interaktionen und sehr deutlich auch unterschiedliche Zellmorphologien auf 2D- und 3D-Mikroumgebungen. Die Kombination von Nanoscribes Zwei-Photonen-Polymerisation und IP-Visio vereinfacht die Entwicklung komplexer biomimetischer Umgebungen aus einem zellfreundlichen Biomaterial, das mechanische, biochemische und geometrische Stimuli für Zellen liefern kann.

Das Verhalten von Krebszellen bei der Protonentherapie erforschen

Mithilfe der Möglichkeiten des hochpräzisen 3D-Drucks und eines geeigneten Biomaterials werden 3D-gefertigte Gerüste hergestellt und als Mikroumgebung für Glioblastome verwendet. Nach der Sterilisation der Gerüste werden Glioblastomzellen 5 Tage lang auf den Gerüsten kultiviert. Dasselbe Verfahren wird zu Vergleichszwecken für 2D-Sockel wiederholt.

GIF einer Design und REM-Aufnahme des Mikrogerüsts 3D-gedruckt mit Nanoscribes Zwei-Photonen-Polymerisation
Design und REM-Aufnahme des Mikrogerüsts 3D-gedruckt mit Nanoscribes Zwei-Photonen-Polymerisation. Bild: Quellenhinweis unten in dieser News
REM-Aufnahme von dreidimensionalen Glioblastom-Zellnetzwerken auf 3D-gedruckten Gerüststrukturen
REM-Aufnahme von dreidimensionalen Glioblastom-Zellnetzwerken auf 3D-gedruckten Gerüststrukturen. Bild: TU Delft.
Konfokale Bilder zeigen die 3D-Glioblastom-Zellkultur (links), die die gesamte Struktur besiedelt, und die flache 2D-Zellmonolage (rechts)
Konfokale Bilder zeigen die 3D-Glioblastom-Zellkultur (links), die die gesamte Struktur besiedelt, und die flache 2D-Zellmonolage (rechts). Bild: Quellenhinweis unten in dieser News
Ein fluoreszierende (in grün) zeigt eine höhere Anzahl von DNA-Schadensherden in den Zellen (Zellkerne in blau) auf 2D-Sockeln (obere Bilder) im Vergleich zu den 3D-Gerüste (untere Bilder).
Ein fluoreszierender Biomarker zeigt eine höhere Anzahl von DNA-Schadensherden (in grün) in den Zellkernen (in blau) auf 2D-Sockeln (obere Bilder) im Vergleich zu den 3D-Gerüste (untere Bilder). Dies deutet darauf hin, dass die DNA von Glioblastomzellen in 3D-Zellkulturen weniger geschädigt wird als in 2D-Zellmonolayern. Zellkulturen werden vor (Control) und nach der Bestrahlung mit unterschiedlichen Dosen (2Gy, 8 Gy) gezeigt. Bild: Quellenhinweis unten in dieser News. Die Bilder wurden aufgehellt.

Nach dieser Zeit werden die zellbesiedelten Gerüste einer Protonenbestrahlung unterzogen. Danach werden die Zellen auf den 2D-Sockeln und den 3D-gedruckten Mikroumgebungen vor und nach der Protonenbestrahlung mittels konfokaler Mikroskopie analysiert. In den konfokalen Bildern zeigt ein fluoreszierender Biomarker (Gamma H2A.X) eine signifikant höhere Anzahl von DNA-Schadensherden in den Zellen auf 2D-Sockeln im Vergleich zu den 3D-Mikroumgebungen. Die Experimente zeigen also für 3D-Zellkulturen eine geringere schädliche Wirkung auf die DNA von Glioblastomzellen als in 2D-Zellmonolagen, was mit der In-vivo-Reaktion von Glioblastomzellen korreliert. Diese Ergebnisse könnten auf einen Unterschied in der Strahlenresistenz von Glioblastomzellen oder in der Reparaturkinetik zwischen 2D-Zellmonolagen und 3D-Zellnetzwerken zurückzuführen sein. Die neuartigen 3D-Mikroumgebungen sind ein vielversprechendes Benchmarking-Tool, um die Auswirkungen der Protonentherapie auf Glioblastomzellen und andere Arten von Krebszellen zu untersuchen.
 

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[1] Global Cancer Statistics 2020

Bildquelle: CC by 4.0 Qais Akolawala et al., ACS Appl. Mater. Interfaces 2022, 14, 18, 20778–20789, doi: 10.1021/acsami.2c03706. Die Bilder wurden an die gewünschten Formate angepasst.

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